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1. 介紹

牛奶中的黃曲霉毒素 M1 被認為是劇毒物質(zhì)，國際癌癥機構將黃曲霉毒素M1列入一類致癌物清單中，歐盟規(guī)定其限量為0.05μg/kg。黃曲霉毒素M1可通過側向?qū)游鲈嚰垪l進行快速檢測，并通過 ELISA 進行定量，檢測時間至少為15分鐘和90分鐘。由于免疫層析技術中免疫化學的局限性，為實現(xiàn)歐盟限量中的高靈敏度造成了障礙。因此，ELISA 檢測方法仍然是黃曲霉毒素 M1 定量篩選最可靠的方法。

2. 研究目的

此研究的目的是對比一種創(chuàng)新的免疫層析檢測和 ELISA 方法對牛奶樣品中黃曲霉毒素M1的定量檢測能力。

3. 研究方法

指示型側向?qū)游鲈嚰垪l由高親和力單克隆抗體、結合膠體金、一條化學修飾的半抗原測試線和一條抗體對照線組成?？裹S曲霉毒素 M1 使用正在申請專利的O.H.C.M.I.T 技術生產(chǎn)（半抗原載體摩爾濃度優(yōu)化型免疫原性技術）。在小鼠免疫接種和雜交瘤制備完成后，篩選克隆并使用蛋白 G 柱純化?；谶@些特異性抗體，創(chuàng)建了對稱型黃曲霉毒素M1側向?qū)游鰷y試產(chǎn)品（Symmetric M1），這款競爭性免疫測定產(chǎn)品，僅需10分鐘即可完成檢測，且樣品無需前處理。黃曲霉毒素M1的濃度由量化系統(tǒng) S-Flow 分析得出。S-Flow系統(tǒng)使用新型對稱量化技術，正在申請專利。掃描系統(tǒng)由 Lateral Logic有限公司提供。用于側向?qū)游鲈嚰垪l測定的所有樣品（產(chǎn)品信息：Symmetric M1黃曲霉毒素檢測試紙條，S2196，批號S2196006，由 Prognosis Biotech S.A.股份有限公司提供）同時使用 ELISA 試劑盒進行測定（產(chǎn)品信息：Bio-Shield M1 ES，B2096，批號B2096040，由Prognosis Biotech S.A. 股份有限公司提供）。

4. 研究結果

此研究中的 ELISA 試劑盒使用受控包被工藝，抗體具有穩(wěn)定的結合活性和較高特異性的特點，具有低基質(zhì)效應和較優(yōu)的回收水平。在 2013-2017年多次奶或奶酪環(huán)測試（Ring Test）結果中，Z分數(shù)的平均值為-0.0087（圖1）。

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圖1: 2013-2017 年度奶或奶酪環(huán)測試中 Z 分數(shù)水平

在均質(zhì)牛奶（CHM），牛奶原奶（CRM），山羊奶原奶（GRM）和綿羊奶原奶（SRM）四種奶樣品中添加五種不同水平濃度的 AFM1（12.5、25、37.5、50、75ppt）作檢測分析，結果發(fā)現(xiàn)每種奶樣品在 ELISA和側向?qū)游鰴z測中的回收率平均值幾乎相同。具體來看，ELISA檢測的平均回收率分別為97.6%、98.4%、102.5%和100.7%，側向?qū)游鰴z測分別為97.9%、97.5%、97.3%和 98.0%（圖2）。

圖2: ELISA和側向?qū)游鰧Σ煌瑯悠分刑砑硬煌瑵舛赛S曲霉毒素M1檢測的回收率水平

以上結果通過檢測上述樣品中不同濃度的黃曲霉毒素 M1（表1）和參考物質(zhì)（圖3）得到證實。2017年在AIA 環(huán)測試中（注 AIA:意大利育種協(xié)會，管理意大利所有肉產(chǎn)品和奶產(chǎn)品的生產(chǎn)）對乳制品中黃曲霉毒素M1檢測，Bio-Shield M1 ELISA試劑盒（61號）和Symmetric M1側向?qū)游鲈嚰垪l（98號）分別在99個參加者中排名第2（Z分數(shù)：0.04）和第5（Z分數(shù)：0.2）（表2）（圖4）。在5名側向?qū)游鲈嚰垪l參加者中，Symmetric M1 排名第1（圖5）。

圖3: ELISA 和側向?qū)游鰴z測參考物質(zhì)的回收率水平

表 1: 相對偏差(%) (ELISA結果(ppt)/側向?qū)游鼋Y果(ppt)

表2: 2017年9月乳品中黃曲霉毒素M1 AIA 環(huán)測試結果RT M1 260917

圖4: 2017年9月乳品中黃曲霉毒素M1 AIA 環(huán)測試RT M1 260917 所有參加者 Z-分數(shù)結果

圖5: 2017年9月黃曲霉毒素M1 AIA環(huán)測試RT M1 260917中側向?qū)游鰠⒓诱?Z-分數(shù)

高親和力抗體和高級定量系統(tǒng)的結合有助于獲得較大范圍的標準曲線。根據(jù)掃描設備的結果，ELISA 和側向?qū)游鲈嚰垪l的曲線圖以及回收率水平幾乎相同。

5. 結論

??? 該創(chuàng)新的對稱型側向?qū)游龇椒ㄊ菣z測乳制品中黃曲霉毒素 M1快速定量檢測方法中最準確的工具，其結果可與定量 ELISA 結果相媲美。

2018年8月 Bio-Shield M1 ES試劑盒及Symmetric M1定量試紙條通過ILVO驗證（ILVO: Flanders research institute for agriculture, fisheries and food. Technology and Food Science unit, Belgium.比利時弗拉芒農(nóng)業(yè)漁業(yè)和食品研究所，被譽為歐洲的AOAC）。

ILVO 研究報告

S-Flow 分析系統(tǒng)